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荧光定量 PCR 仪光学校正现状及校正系统

编辑:永利电玩城????来源:未知????发布时间:2019-10-30 09:36????浏览量:
1 荧光定量 PCR 仪校正现状
相对于传统 PCR 仪, 荧光定量 PCR 仪的影响因素更为复杂, 主要因素包含化学试剂、温度模块的温度因数、顶盖温度因数、镜头、反光镜和光路通道、荧光接收器的敏感度、机械组成部分、荧光信号处理App的阈值设定, 如基线, 基线设定, S/N 比例探测等,这就为荧光定量 PCR 永利电玩城官方网站带来了巨大的挑战。
 
国内校正机构目前针对荧光定量 PCR 永利电玩城官方网站主要分为两种情况: 一种是仅对荧光定量 PCR 仪的温场部分进行校正, 这种方法无法对荧光定量PCR 仪光学部分进行校正, 所获得的结果不能对荧光定量 PCR 仪的性能进行全面评估; 另外一种方法是利用化学试剂对荧光定量 PCR 仪的进行荧光检测, 这种方法同样存在极大缺陷。首先采用化学方法对定量 PCR 仪荧光系统进行永利电玩城官方网站, 无法溯源到任何国际公认的标准, 不具备溯源性。其次, 梯度稀释试剂的过程中由于人为操作会引入一定的误差, 误差值可能较大, 直接影响到最终的检测结果。最重要的是, 采用这种方法进行永利电玩城官方网站, 无法说明荧光定量PCR 仪的温度和荧光对最终定量结果的影响关系,误差多少及误差来源等。
 
随着定量 PCR 仪的应用越来越广泛, 使用者迫切需要对荧光定量 PCR 仪的性能进行全方位的评估。在现有检测手段无法满足需求的情况下, 荧光定量 PCR 仪使用者普遍采用两种方式自行对仪器状态进行判断, 一种是使用生物试剂测试盘这种检测方法和采用已知浓度的质粒 DNA 标准物质对样本线性误差进行永利电玩城官方网站的方法都属于化学方法, 这种方法仅能够针对孔与孔间的组合线性进行测量, 所得结果仅能代表 PCR 仪孔与孔间的平均结果, 不能代表单孔的线性, 无法真实反映仪器的性能。另一种方法是采用多台不同厂家或型号定量 PCR 仪实验比对的方式来比较不同仪器间的系统误差, 判断系统误差是否在临床接受范围内。[2] 这种方法既不具备溯源性, 又需要对单个项目进行实验比对, 成本较高。影响定量 PCR 仪结果重复性的 2 个主要原因是边缘效应和实验误差, 而边缘效应是由于光路设计缺陷和控温模块缺陷导致的。[3] 如果光路设计存在缺陷, 会导致 PCR 仪样品槽的边缘孔和中间孔光程存在差异, 不同反映孔间荧光基团获得的激发光能量存在差异, 最终影响实验结果。同时, 加热模块的空间温差同样会导致这种边缘效应, 研究表明, 孔间温差的微小差别可能在基因扩增的过程中被指数级放大, 最终影响实验结果。[4] 此外, 光路设计缺陷和孔间温差的存在还会直接影响到熔解曲线的结果, 使得不同仪器对熔解曲线的分辨率存在明显差异。[5] 在通过熔解曲线检测突变或进行单核苷酸多态性分析时, 这种影响会导致无法成功区分突变基因或误判突变基因。[6]
 
因此, 对定量 PCR 仪更加全面科学的永利电玩城官方网站方式是采用可溯源物理手段同时对荧光定量 PCR 仪的温度部分和光学部分进行永利电玩城官方网站, 并分析二者之间的联系, 以保障实验结果的准确性。
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2 Cyclertest 3D optical 定量 PCR 仪光学校正系统
基于上述定量 PCR 仪校正需求, 本文采用 Cyclertest 3D optical 定量 PCR 仪光学校正系统对定量PCR 仪的温场和荧光系统进行全面校正。系统在原有的 PCR 仪温度校正系统基础上运用可溯源光谱理论, 将温度和荧光检测相结合, 模拟定量 PCR仪试验, 不仅可以对温度模块、上盖温度进行检测,还能同时对荧光系统进行检测, 并分析而二者的相关性, 更准确地确定定量 PCR 仪误差及误差来源。检测系统镶嵌经校正并可用光谱仪溯源的发光LEG, Light Generating Element, 通过给定电流量的不同会产生不同区强度的荧光模拟标准荧光激发, 并通过对荧光激发部分的温度控制, 前端传感器示意图见图 1。
 
这种设计避免了光谱的漂移, 保证 LEG的激发光在运行过程中保持绝对的同一水平, 这种采用物理手段进行检测, 避免了人为操作引入的误差, 更加准确。这种荧光检测方法通过了国际专利认证, 运用了可溯源光谱理论, 可溯源温度计量来对荧光定量 PCR 进行完全的检测, 系统根据溯源性、可靠性和准确性。系统温度部分可以对定量 PCR 仪的温度准确度、孔间温差、实时升温速率、实时降温速率、温度过冲、温度持续时间、上盖温度进行永利电玩城官方网站。荧光部分可以对定量 PCR 仪的 Cq( Ct) 相差值、精确度、荧光饱和值、荧光线性、熔解曲线精确度及一致性, 熔解温度的比例关系及线性灵敏度等进行检测。
 

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